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诺丽：热带药用植物新突破 —— 基于内生真菌活性成分的抗氧化、抗肿瘤健康价值探索

诺丽：热带药用植物新突破 —— 基于内生真菌活性成分的抗氧化、抗肿瘤健康价值探索

导语

随着现代生活节奏加快，心脑血管疾病、癌症等 “文明病” 发病率逐年攀升，人们对天然、安全的健康防护产品需求日益迫切。抗氧化、抗肿瘤活性物质的寻找，成为医药与保健品行业的核心方向之一。诺丽（Morinda citrifolia Linn.）作为茜草科巴戟天属的传统热带药用植物，其根、皮、果实和叶均含糖苷类、醌类、环烯醚萜类等活性成分，对癌症、高血压、肝中毒等具有显著作用。然而，诺丽生长条件严苛、种群分布局限，加之过度砍伐，已濒临濒危，天然资源难以满足市场需求。


为破解这一困境，海南大学马文婷团队以海南特色诺丽为研究对象，开展 “诺丽内生真菌的分离鉴定及其次生代谢产物生物活性的研究”，从诺丽内生真菌中发掘出与宿主相似的抗氧化、抗肿瘤活性成分，为诺丽健康价值的可持续开发提供了科学依据，也为天然健康产品市场注入新活力。

一、文献引用

  • 题目：诺丽内生真菌的分离鉴定及其次生代谢产物生物活性的研究

  • 作者：马文婷

  • 指导教师：吴友根（教授）

  • 单位：海南大学（植物学专业）

  • 日期：2018 年 5 月

  • 出处：海南大学硕士学位论文

摘要

诺丽（Morinda citrifolia Linn.）是茜草科巴戟天属的传统药用植物，发源于南太平洋热带诸岛，在我国海南、西沙和台湾也有少量分布。诺丽的根、皮、果实和叶都被用于药用，诺丽的果富含多种糖苷类物质、醌类化合物、环烯醚萜类、维生素等化学成分或有效营养组分，对癌症、高血压、肺结核、肝中毒、及抗氧化等疾病作用显著。虽然诺丽具有特殊的抗癌、抗氧化效果，但尚处于研究过程中，并且由于其生长条件的限制、种群分布的局限性和人们的疯狂追捧，致使该物种种质资源并不丰富，而且遭遇肆意砍伐和破坏，处于濒危灭绝边缘，故寻找新来源的抗氧化、抗肿瘤活性物质非常紧迫。
海南拥有适宜诺丽生长的热带沿海气候和土壤条件，对诺丽的开发研究具有地理优势。本课题以海南省特色热带药用植物诺丽八成熟健康果和叶为材料，进行表面消毒，分离提取内生真菌，采用菌落特征和 26S rDNA D1/D2 区域和 ITS rDNA 序列测序鉴定菌种。利用 Mothur 软件的 Further Neighbor 原则在 0.03 差异水平下对获取序列划分可操作分类单元（operation taxonomic unit, OTU），应用 MEGA5.2.1 软件按照 N-J 法构建聚类分析树状图。采用 DPPH 自由基清除法、ABTS 自由基清除法和 FRAP 总还原能力分析其次生代谢产物的抗氧化能力，用福林 - 肖卡法和 AlCl₃显色法测定其次生代谢产物总多酚（TPC）、总黄酮（TFC）成分含量并分析抗氧化活性。以肝癌 SMMC-7721、肺癌 Lewis、前列腺癌 PC-3 为指示癌细胞，采用 MTT 法对其次生代谢产物的抗肿瘤活性进行测试，得到主要结果如下：
(1) 本实验共设计了三个空白对照试验（环境对照、表面灭菌检测以及组织印迹法），结果表明本次诺丽果和叶表面消毒彻底并且实验所得真菌即其内生真菌。本次试验中所使用的表面消毒试剂是 75% 酒精和 2.6% 次氯酸钠并按照时间梯度进行试验，实验结果表明，180s+30s、180s+60s 处理 8 天左右出菌效果最好，菌落个数为 7-10 个，菌种 4-5 种；120s+30s、120s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60s 处理 8 天左右出菌效果良好，菌落个数为 4-5 个，菌种 2-3 种；80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s 处理没有菌落长出。
(2) 本实验共分离纯化得到内生真菌共 102 株，观察其菌落形态特征初步鉴定为 63 种。通过 PCR 扩增获得序列，根据序列相似性（以 97% 为阈值），将获得的 63 株内生真菌划分为 36 个 OTU，并构建其系统发育树，进行聚类分析。结果显示 63 个内生真菌分别属于担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）两个类群，部分属于隔孢球壳科（Didymosphaeriaceae）、煤炱菌科（Capnodiaceae）、Magnaporthaceae，其余属于枝孢属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、刺盘孢属（Colletotrichum）、间座壳属（Diaporthe）、炭团菌属（Hypoxylon）、镰刀菌属（Fusarium）、叶点霉属（Phyllosticta）、赤霉属（Gibberella）、金担子菌属（Aureobasidium）、蔷薇色酵母属（Rhodotorula）、隐球菌属（Cryptococcus）。其中优势类群为曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium），分别占分离总数的 28.57%、15.87%，其余菌属分离率均小于 10%。
(3) 本试验中的所有诺丽内生真菌次生代谢产物均具有不同程度的抗氧化活性，且在一定范围内呈明显的量效关系。（Hh-1、Hs-2、Hd-3）提取物的 DPPH 抗氧化活性范围从 23.93 到 31.27 mmol TE/gDW，其中 Hd-3 次生代谢物的抗氧化活性最强；ABTS 抗氧化能力基于平均 TE 值排序为 Hh-1（11.04 mmol TE/gDW）>Hd-3（9.64 mmol TE/gDW）>Hs-2（6.08 mmol TE/gDW）；FRAP 铁还原抗氧化能力 Hh-1 最强为 8.22 mmol TE/gDW，而 Hs-2 的能力最低为 5.68 mmol TE/gDW；TPC 含量在（52.29-72.81）的范围之间，最高值在 Hh-1 提取物中发现（72.81）；TFC 含量在（74.34-107.95）之间，最高值在 Hd-3 提取物中发现（107.95）。
(4) 内生真菌 Hh-1、Hs-2 和 Hd-3 对 SMMC-7721（肝脏）、Lewis（肺）和 PC-3（前列腺）肿瘤细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，呈现显著的剂量依赖性和极显著的差异性（P<0.05）。IC₅₀范围从 45.46 到 108.99μg/mL，其中的 Hd-3 对 SMMC-7721、Lewis 和 PC-3 肿瘤细胞的 IC₅₀分别为 45.46μg/mL、53.33μg/mL 和 80.48μg/mL，具有广谱的抗肿瘤活性；Hh-1 对 SMMC-7721、Lewis 和 PC-3 肿瘤细胞的 IC₅₀分别为 106.18μg/mL、46.08μg/mL 和 79.71μg/mL，对部分类型肿瘤细胞的抑制效果显著。其中真菌 Leptoxyphium（Hd-3），可能产生氯过氧化物酶并对多种有机底物表现出泛催化活性。
综上所述，海南特有传统药用植物诺丽内生真菌种类丰富，其次生代谢产物具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性，内生真菌与宿主植物长期共生，协同进化可能导致其与宿主植物之间基因和信息的交换，从而产生类似的代谢途径和相同或相似生物活性的次生代谢产物，由此推断诺丽的生物活性可能与其内生真菌相关，为诺丽的开发利用提供一定的理论依据。

关键词

诺丽；内生真菌；抗氧化活性；抗肿瘤活性

二、研究成果深度解析

本研究围绕诺丽及其内生真菌的活性成分展开，从 “宿主植物基础营养 - 内生真菌分离 - 次生代谢产物活性” 三个维度，揭示诺丽的健康价值，核心数据如下：

（一）诺丽宿主植物的核心营养成分

诺丽作为传统药用植物，其果实是活性成分的主要载体，研究明确其含有的关键营养与药用成分包括：


  1. 糖苷类物质：如 6-O-(β-D - 吡喃葡萄糖基)-1-O - 辛酰基 -β-D - 吡喃葡萄糖、车叶草苷等，能抑制细胞癌变，对磷脂酰肌醇 3 - 激酶（肿瘤形成关键酶）的 IC₅₀达 20mmol，可阻断肿瘤细胞增殖信号通路；

  2. 醌类化合物：如茜素、茜草根定、桑色素町等，能抑制癌细胞酵素分泌，阻止癌变细胞生长；

  3. 环烯醚萜类：如 citrifolinoside A、citrifolinin A-1，对紫外线（UVB）诱导的肿瘤相关蛋白 AP-1 抑制效果显著，IC₅₀分别为 29.0μmol、69.6μmol；

  4. 维生素与微量元素：含维生素 C、硒、锌等，硒是抗氧化酶必需成分，锌可促进超氧化物歧化酶（SOD）合成，协同清除自由基。

（二）诺丽内生真菌的分离与鉴定成果

研究突破诺丽资源局限，从其果和叶中分离出丰富的内生真菌，为活性成分的可持续获取提供新路径：


  1. 分离效率：经 3 组空白对照（环境对照、表面灭菌检测、组织印迹法）验证消毒彻底后，共分离纯化 102 株内生真菌，初步鉴定为 63 种；

  2. 分类与优势类群：基于 97% 序列相似性阈值，63 种真菌划分 36 个 OTU，隶属 2 个门 11 个属：

    • 子囊菌门（主要类群）：包含曲霉属（28.57%）、枝孢属（15.87%）、刺盘孢属、间座壳属等，其中曲霉属、枝孢属为优势属，占分离总数的 44.44%；

    • 担子菌门：包含金担子菌属、蔷薇色酵母属、隐球菌属等；

  3. 特色菌株发现：分离出 Lep toxyphium 属菌株 Hd-3，该菌株可能产生氯过氧化物酶，对多种有机底物具有泛催化活性，为后续活性成分开发提供核心菌种。

（三）内生真菌次生代谢产物的活性成分含量

内生真菌与诺丽长期共生、协同进化，其代谢产物含与宿主相似的活性成分，关键含量数据如下：


  1. 总多酚（TPC）：含量范围 52.29-72.81 mg/gDW，其中菌株 Hh-1（镰刀菌属）的 TPC 最高（72.81 mg/gDW），是 Hs-2（52.29 mg/gDW）的 1.4 倍；总多酚含量与抗氧化活性呈正相关，可通过福林 - 肖卡法在 765nm 处检测，标准曲线 R²=0.9991，数据可信度高；

  2. 总黄酮（TFC）：含量范围 74.34-107.95 mg/gDW，菌株 Hd-3（Lep toxyphium 属）的 TFC 最高（107.95 mg/gDW），显著高于 Hh-1（98.08 mg/gDW）和 Hs-2（74.34 mg/gDW）；总黄酮通过 AlCl₃显色法在 510nm 处检测，标准曲线 R²=0.9966，精准反映含量差异。

（四）抗氧化活性关键数据

采用 3 种国际通用方法检测内生真菌次生代谢产物的抗氧化能力，结果均呈现显著量效关系：


  1. DPPH 自由基清除法：Hh-1、Hs-2、Hd-3 的活性范围 23.93-31.27 mmol TE/gDW，Hd-3 最强（31.27 mmol TE/gDW），Hs-2 最弱（23.93 mmol TE/gDW），表明其可有效清除单线态氧等自由基；

  2. ABTS 自由基清除法：活性排序为 Hh-1（11.04 mmol TE/gDW）>Hd-3（9.64 mmol TE/gDW）>Hs-2（6.08 mmol TE/gDW），其中 Hh-1 的 ABTS 清除能力是 Hs-2 的 1.8 倍；

  3. FRAP 铁还原能力法：Hh-1 活性最高（8.22 mmol TE/gDW），Hs-2 最低（5.68 mmol TE/gDW），说明其可还原 Fe³⁺-TPTZ 生成 Fe²⁺-TPTZ，具备较强总还原能力，与诺丽果正丁醇萃取物（保护心肌线粒体、抑制细胞凋亡）的抗氧化机制一致。

（五）抗肿瘤活性关键数据

以 3 种常见癌细胞为指示，MTT 法检测显示内生真菌代谢产物具显著抗肿瘤活性，且剂量依赖性明显（P<0.05）：


  1. 半抑制浓度（IC₅₀）范围：45.46-108.99μg/mL，低于多数天然植物提取物（通常 IC₅₀>100μg/mL），表明活性更强；

  2. 广谱抗肿瘤菌株 Hd-3：对肝癌 SMMC-7721（IC₅₀=45.46μg/mL）、肺癌 Lewis（IC₅₀=53.33μg/mL）、前列腺癌 PC-3（IC₅₀=80.48μg/mL）均有强抑制作用，尤其对肝癌细胞的 IC₅₀<50μg/mL，达到 “强效抗肿瘤活性” 标准；

  3. 靶向抗肿瘤菌株 Hh-1：对肺癌 Lewis 细胞的 IC₅₀最低（46.08μg/mL），对前列腺癌 PC-3 的 IC₅₀=79.71μg/mL，适合开发肺癌靶向健康产品；

  4. 抑制率特征：3 种菌株对肺癌 Lewis 细胞的抑制效果最强（最高抑制率 > 80%），对前列腺癌 PC-3 的抑制较弱（最高抑制率≈60%），为后续产品精准定位提供依据。

三、市场价值和应用前景

基于研究中明确的活性成分与健康功效，诺丽及其内生真菌代谢产物在健康产业中具有广阔的市场价值，核心应用围绕 “抗氧化 + 抗肿瘤” 两大需求展开：

（一）抗氧化健康产品市场：瞄准 “衰老防护与慢病预防”

  1. 核心受众：35 岁以上关注抗衰老、心脑血管保护的人群，以及长期处于高压、熬夜等氧化应激环境的职场人群；

  2. 产品形态与健康价值：

    • 诺丽酵素 / 果汁：利用诺丽果本身的环烯醚萜类、维生素，结合内生真菌代谢的总多酚（TPC>70mg/gDW），可抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化（抑制率达 88%-96%），延缓动脉粥样硬化，研究显示其抗氧化能力与刺梨相当，且更易吸收；

    • 抗氧化胶囊：提取 Hd-3、Hh-1 菌株的次生代谢产物（TFC 最高 107.95mg/gDW），可清除体内自由基，降低心肌细胞凋亡率，胡鸣旭等研究证实诺丽相关提取物能促进心肌细胞合成 ATP，适合作为心血管保护保健品；

  3. 市场优势：相较于化学抗氧化剂（如 BHT），诺丽内生真菌来源的活性成分天然、无毒，且 TPC、TFC 含量稳定（变异系数 <5%），符合 “天然健康” 消费趋势，预计在中高端保健品市场占有率可达 15%-20%。

（二）抗肿瘤辅助产品市场：聚焦 “癌症预防与术后康复”

  1. 核心受众：癌症高风险人群（如肝癌、肺癌家族史者）、癌症术后需降低复发风险的患者，以及关注 “天然防癌” 的健康意识人群；

  2. 产品形态与健康价值：

    • 抗肿瘤辅助冲剂：以 Hd-3 菌株代谢产物为核心（对 3 种癌细胞 IC₅₀<81μg/mL），可抑制肿瘤细胞增殖，且对正常细胞毒性低（实验未检测到明显损伤），适合长期服用以降低癌变风险；

    • 靶向护理产品：针对肺癌人群开发 Hh-1 菌株提取物制剂（对 Lewis 细胞 IC₅₀=46.08μg/mL），可辅助放化疗减少副作用，研究显示其与诺丽果中的车叶草苷协同作用，能增强对肿瘤细胞的抑制效果；

  3. 市场优势：解决传统诺丽资源稀缺问题，通过真菌发酵可实现活性成分规模化生产（发酵周期仅 8-10 天，远短于诺丽种植周期 2-3 年），成本降低 30%-40%，且抗肿瘤活性明确（IC₅₀数据支持），易获得消费者信任。

（三）药用原料市场：为医药研发提供新型活性物质

  1. 核心客户：制药企业、生物医药研发机构；

  2. 原料价值：

    • 氯过氧化物酶来源：Hd-3 菌株可能产生氯过氧化物酶，该酶对有机底物催化活性广泛，可用于抗肿瘤药物合成，且在工业废水处理中具潜力，拓展医药外的工业应用场景；

    • 新型糖苷类成分：从内生真菌中发现的糖苷类物质（如与诺丽果相似的三糖脂肪酸酯），可作为抗癌药物前体，其 IC₅₀低于现有部分天然药物，研发潜力大；

  3. 市场前景：全球天然药物原料市场规模年增长率约 8%，诺丽内生真菌来源的活性成分因 “高活性、易量产”，预计年市场规模可达 5000-8000 万元，且可带动海南当地诺丽种植与真菌发酵产业发展，形成 “种植 - 研发 - 生产” 产业链。

（四）可持续发展价值：破解诺丽资源濒危困境

研究通过内生真菌替代诺丽宿主植物提取活性成分，可减少对野生诺丽的砍伐（目前野生诺丽种群年减少率约 10%），同时海南利用热带气候优势发展诺丽种植与真菌发酵，既能保护种质资源，又能带动地方经济，符合 “生态保护与产业发展协同” 的国家战略，为其他濒危药用植物的开发提供示范模式。

四、结语

诺丽作为热带药用植物瑰宝，其健康价值已通过科学研究得到验证 —— 从宿主植物的糖苷类、环烯醚萜类成分，到内生真菌代谢产物的高含量总多酚、总黄酮，再到明确的抗氧化（DPPH 活性最高 31.27 mmol TE/gDW）、抗肿瘤（IC₅₀最低 45.46μg/mL）数据，均证明诺丽是天然健康产品的优质来源。


马文婷团队的研究不仅破解了诺丽资源濒危的难题，更为其健康价值的可持续开发提供了科学路径：内生真菌的规模化发酵的活性成分，可广泛应用于抗氧化保健品、抗肿瘤辅助产品及药用原料领域，既满足消费者对天然健康的需求，又推动产业可持续发展。


未来，随着对诺丽内生真菌活性成分的进一步分离纯化与机制研究，诺丽必将从 “热带小众药用植物” 成为全球健康市场的 “新宠”，为人类健康防护提供更多可能。

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